真核细胞中，m6A是最多的RNA修饰形式。核心亚基METTL3、METTL14、WTAP和其他蛋白KIAA1429、RBM15组成甲基转移酶【1】，即m6A‘writer’，识别序列RRACH，催化形成m6A。FTO、ALKBH5介导m6A的去甲基化【2,3】。m6A的功能性研究目前已经取得巨大的进步，但是mRNA特定位点甲基化的功能还不清楚。实际上，m6A在mRNA上的分布并不均匀，大部分的甲基化集中在终止密码附近【4】，在5’UTR和起始密码子也有m6A的峰。对于m6A的研究主要基于对修饰酶的干扰，导致对整体RNA甲基化的影响；或者对甲基化位点进行突变研究m6A的区域性功能，但核苷酸序列的改变可能引入无法预期的特性，使数据的解读变得复杂。目前的研究工具不能区分单个的m6A修饰的功能。
CRISPR-Cas9技术发展迅速，已经实现精确的基因组编辑功能，包括靶向的DNA切割/修复、直接的碱基编辑以及位点特异的表观基因组编辑。通过将催化部位失活的Cas9（dCas9）与DNA或组蛋白修饰酶融合，gRNA招募Cas蛋白到特异的位点，实现表观基因组的编辑。同样的思路，如果将RNA碱基修饰酶与Cas蛋白相融合，或许将实现位点特异的RNA修饰编辑。
2019年8月5日，美国康奈尔大学的Shu-Bing Qian团队在Nature Chemical Biology上发表了题为 Programmable RNA N6-methyladenosine editing by CRISPR-Cas9 conjugates 的文章，报道了在RNA上进行m6A修饰的写入和擦除的新工具，通过融合CRISPR-dCas9和m6A甲基转移酶实现对mRNA的3’UTR和5’UTR区域的单个位点的m6A特异性写入；通过融合CRISPR-dCas9和ALKBH5或FTO实现对RNA位点特异性的去甲基化。
结构学分析显示甲基转移酶中METTL3是催化核心，METTL14是RNA结合平台。METTL3-METTL14异源二聚体具备强烈的催化活性。研究人员构建了M3M14-dCas9和催化核心失活的M3D395AM14-dCas9融合蛋白，在人源HEK293T和鼠源MEF中表达，发现两个融合蛋白主要定位在细胞质中，与内源的METTL3、METTL14定位在细胞核中不同。虽然生理上m6A修饰写入发生在新生RNA（nascent RNAs）转录过程中，但细胞质内的m6A写入工具为研究成熟RNA的de novo甲基化功能提供了可能。与DNA靶向dCas9类似，sgRNA和PAMer结构对于M3M14-dCas9与靶标RNA结合是必需的。研究人员首先选取Hsp70（Hspa1a）mRNA的5’UTR检测M3M14-dCas9是否能够写入m6A修饰。在基本不表达Hspa1a的MEF细胞中引入携带Hspa1a 5’UTR的荧光素酶报告系统，检测发现在5’UTR的A103位点有本底性m6A修饰。引入M3M14-dCas9和sgRNA、PAMer导致A103位点的m6A增加，而且m6A的写入具有位点特异性（在A1280没有m6A增加）和甲基化酶催化活性依赖（M3D395AM14-dCas9不能增加A103的m6A）。5’UTR对核糖体扫描（ribosome scanning）非常重要。之前的研究表明CRISPR-Cas9靶向5’UTR或编码区将会抑制mRNA翻译过程【5】，而检测发现单独表达sgRNA或PAMer，抑或是与M3M14-dCas9共表达均不影响核糖体扫描过程。相反，在应激条件下，5’UTR甲基化导致Fluc活性增加，而mRNA水平不变，即当帽子依赖性的转录机制被抑制时，5’UTR m6A促进非经典的转录过程。同时5’UTR m6A对mRNA的降解和半衰期没有影响。但是，研究显示3’UTR m6A修饰的增加，显著降低mRNA的半衰期。
FTO和ALKBH5是m6A去甲基化酶，依靠识别m6A的构象上标志发挥作用。研究人员分别构建了ALKBH5-dCas9、FTO-dCas9以及相应失活突变体，表达后发现融合蛋白主要定位于细胞核内，而且没有改变整体的m6A状况。Malat1是细胞中含量丰富的lnc-RNA，在A2577位点具有高程度的甲基化。研究人员利用sgRNA靶向A2577位点，ALKBH5-dCas9、FTO-dCas9显著降低甲基化。这种去甲基化具有酶活性依赖和位点特异性。并证明A2577位点的m6A促进Malat1的U-tract与HNRNPC蛋白结合，而去甲基化导致HNRNPC蛋白的解离。所以m6A编辑能够重塑RNA的结构，调控RNA和RNA结合蛋白之间的相互作用。
总之，研究发展了位点特异性的m6A写入和擦除工具，在不改变核苷酸序列和整体m6A状态的情况下对RNA甲基化进行编辑，为研究表观转录组学提供了新工具。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41589-019-0327-1
（责任编辑：tqh）
