流式染色中,最难的是破膜,了解破膜剂的秘密,能够更好地进行胞内染色。
为什么要进行破膜?
很简单,就是希望研究细胞内部的蛋白分子,正常情况下,荧光标记的抗体无法通过完整的细胞膜,只能在细胞膜上打出足够大的孔,才能使抗体进入细胞内。
一般,破膜主要分为以下几步:
(1)用醛类(多聚甲醛、甲醛、戊二醛)或有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮)固定或稳定细胞膜。
醛类在固定的同时可以增加细胞渗透性,但还不足以使抗体进入。但如果用有机溶剂固定,那么后续的破膜就不需要了。
(2)用去污剂或溶剂破膜。
(3)将细胞与胞内抗体或标记物孵育。
我什么时候需要用去污剂?
用去污剂最常见的应用有:
(1)洗液:在PBS洗液中加入低浓度的去污剂可以减少一些非特异性染色,这个技巧不知道吧?千万别告诉别人:)
(2)破膜:对细胞膜打孔,实现胞内抗原染色。
(3)溶解细胞膜:用去污剂可提取细胞膜成分,进行免疫共沉淀分析。
什么是去污剂?工作原理是什么?
见下图,去污剂由多个单体分子组成,每个单体分子均有亲水的头部和疏水的尾部(图中的a),在高浓度情况下,多个单体分子组合成一个聚合分子(图中的b)。当去污剂与细胞膜脂质层作用时,就能够嵌入到脂质分子中间,随着浓度增加,去污剂就会影响细胞膜结构,使膜上现成小孔(图中的c)。如果浓度进一步增加,去污剂就会把膜成份解离下来,包裹起来,这就是为什么用去污剂处理后膜的成份会丢失
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