新的人抗HBsAg抗体Fab cDNA的克隆及序列分析

廖琪桦　高辉　陈南春　杨安钢　陈苏民　粟宽源　余宙耀
 
　　关键词: 噬菌体抗体;肝炎表面抗原，乙型;人Ig可变区基因;序列分析
    
　　摘 要:目的  从已构建的人抗-HBsAg噬菌体抗体库中筛选出结合乙肝表面抗原（HBsAg）的特异的人噬菌体抗体（Fab段），并进行基因序列分析. 方法  对噬菌体抗体库进行三轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，使特异性噬菌体抗体得到了富集.ELISA实验和ELISA竞争抑制实验鉴定出乙肝表面抗原的特异性抗体，同时对筛选出的克隆进行基因序列分析. 结果  得到与乙肝表面抗原特异结合的抗体，并通过基因序列分析证明为抗乙肝HBsAg的抗体. 结论  得到的抗乙肝HB-sAg的特异抗体为下一步表达纯化工作奠定了基础.
    
　　Screening of phage antibodies to hepatitis B surface antigen and analysis of human anti┐HBs antigen Fab gene
    
　　LIAO Qi-Hua　GAO Hui　CHEN Nan-Chun　YANG An-Gang　CHEN Su-Min　SU Kuan-Yuan　YU Zhou-Yao
    
    1 Department of Biochemistry and Molecular Biolo-gy，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi’an710033，China，
    
　　2 Hepatology Center of Chinese PLA，Air Force Guangzhou Hospital，Guangzhou510600，China
     
　　Keywords:phage antibodies;hepatitis B surface antigens;human Ig verified region gene;sequence analysis Abstract:AIM To screen phage antibodies（Fab fragments）to hepatitis B surface antigen（HBsAg）from the constructed phage display library，and to analyse it with DNA sequencing and restriction enzyme mapping.METHODS Three rounds selection against coated HBsAg showed specific enrichment of phage antibodies.The specificity of the clones was verified by ELISA and competition inhibition ELISA.The nucleotide se-quence of the target DNA was determined by the dideoxy chain termination method.RESULTS Phage antibodies（Fab fragments）to hepatitis B surface antigen（HBsAg）were determined by ELISA，competition inhibition ELISA and DNA sequencing.CONCLUSION Specific phage anti-bodies（Fab fragments）may lay a solid foundation for further research into their expression and purification.
    
　　0 引言
    
　　抗体技术经历了多克隆抗血清，单克隆抗体，发展到了基因工程抗体阶段，最突出的是噬菌体展示技术的建立［1］ .该技术用PCR技术扩增抗体全套可变区基因，重组到原核表达载体中，并与丝状噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，表达在噬菌体的表面，这样可用ELISA等的方法，通过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选出特异性抗体的可变区基因.该项技术是抗体技术领域中的一项突破性进展［2］ .我们从已构建的人抗-HBsAg噬菌体抗体库中筛选出抗HBsAg的人单抗，并对筛选出的噬菌体抗体进行序列分析.结果表明抗体重链属于V H I亚类，轻链V L 属于Vκ I亚类.
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 材料  表达载体pComb3H由原我校免疫教研室崔运昌教授惠赠.大肠杆菌菌株XL-Blue及辅助噬菌体VCSM13为我室保存.人抗HBsAg抗体库（滴度为1015 PFU·L-1 ）由本室构建.构建的方法如下［3，4］ :对乙肝疫苗免疫志愿者加强免疫注射后第5日取血，用淋巴细胞分离液按常规分离单个核细胞.提取出其mRNA.分离出的mRNA用第一条链合成试剂盒（Promega公司产品）反转录为cDNA.用设计好的引物PCR扩增出抗体的轻链和重链.将PCR扩增的κ链经SacI和XbaI消化，琼脂糖凝胶电泳分离，电洗脱纯化.pComb3H载体也经SacI和XbaI消化，电泳分离纯化.将消化后的κ链片段和载体片段进行连接，电穿孔转化XL1-Blue细胞，扩增转化后的细菌，提取质粒得到轻链载体DNA.再经XhoI和SpeI消化，与XhoI和SpeI消化后的Fd片段连接，电穿孔转化XL1-Blue，转化后的细菌加3mL SOC，30℃培养1h后加入含50mg·L-1 氨苄青霉素和10mg·L-1 四环素的SB培养液100mL，37℃振荡培养2h，加入约1012 空斑形成单位（PFU）的辅助噬菌体VCSM13，继续培养过夜.离心收集上清，加入PEG-8000到4℃离心弃上清，以2mL含10g·L-1 BSA的PBS溶解沉淀，再以11600g离心5min弃除不溶解物，收集上清即为噬菌体抗体库.所用的PCR引物为:重链5’引物（VH ）:VH1a CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGG VH1f CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG VH2f CAGGTGCAGCTACTCGAGTCGGGVH3a GAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGG VH4f CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG VH4g CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG VH6a CAGGTACAGCTCGAGCAGTCAGG重链3’引物:
CG1a GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGAT TTGGGCG2a CTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTTCG3a TGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGG GTTTTCG4a GCATGAACTAGTTGGGGGACCATAT TTGGAκ链5’引物:Vκ 1a: GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCA Vκ 2a: GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCA Vκ 3a: GAAATTGAGCTCACGCAGTCTCCAκ链3’引物:GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTT GAAGCTCTTTGTGACGGGCGATCTCAG   
     
　　纯化的基因工程重组乙肝疫苗（rHBsAg）为深圳康泰生物制品有限公司产品.HBsAg预包被板:华美生物工程公司产品.SB培养液:30g·L-1 蛋白胨，20g·L-1 酵母提取物，10g·L-1 MOPS，pH7.0.限制性内切酶为宝灵曼公司产品.pComb3H:为一种噬粒（phagemid），系由pComb3改造而来，后者又系pBluescript经系统改造而来.pComb3H含质粒ColE1的起动位点，又含f1噬菌体的复制起始位点，以及氨苄青霉素抗性基因.其插入部位及表达元件如Fig1所示，L链及H链Fd的表达受同一LacZ启动子控制，L链单独表达，H链Fd区与基因Ⅲ产物p3的C端部分融合表达.在不带插段（in-serts）时，整个载体大小为3394bp，加上两个假插段（stuffer，300bp和1200bp）共4894bp.Nhe/SpeI双酶去除基因Ⅲ片段，将使抗体以Fab形式表达.
    
　　图1　略
    
　　1.2 噬菌体抗体库的筛选  取HBsAg预包被板，每孔加入50μL噬菌体抗体库［约1011 个CFU（菌落形成单位）］，37℃培养2h，吸去噬菌体抗体液，以试剂盒内的洗涤液洗1次（第2轮洗5次，第3轮洗10次），蒸馏水洗1次，加入50μL洗脱液（0.1mol·L-1 HCl，以甘氨酸调至pH=2.2，加入BSA至1 g·L-1 ）室温静置10min，将洗脱液稍加吹打后吸出，立即加入3μL2mol·L-1 Tris中和，加入2mL XL1-Blue细胞，室温静置15min进行感染，加入10mL含20mg·L-1 氨苄青霉素，10mg·L-1 四环素的SB，取1μL及10μL铺板测定CFU，其余细菌37℃培养1h后加入100mL含50mg·L-1 氨苄青霉素、10mg·L-1 四环素的SB再37℃培养1h，加入约1012 PFU辅助病毒VCSM1337℃培养过夜.离心收集上清，加入PEG-8000到40g·L-1 ，NaCl到30g·L-1 ，冰浴30min后，6500g4℃离心20min弃上清，以2mL含10g·L-1 BSA的PBS溶解沉淀，再以11600g离心5min弃除不溶解物，收集上清即为噬菌体抗体库，所得的次级噬菌体抗体库可进行再一轮的筛选.
    
　　1.3 噬菌体抗体的制备  挑取含有噬菌体抗体表达载体的XL1-Blue菌落，接种于2mL含50mg·L-1 氨苄青霉素和10mg·L-1 四环素的LB中，37℃振荡培养过夜，取100μL加到2mL含同样量抗菌素的SB中，37℃振荡培养过夜.次日离心收集上清，即为噬菌体抗体，4℃保存.
    
　　1.4 噬菌体抗体的鉴定  ELISA试验:用华美生物工程公司生产的抗-HBsAg的ELISA试剂盒，按照说明书进行操作.
    
　　1.5 ELISA竞争抑制试验  用上述方法筛选出来的阳性克隆噬菌体25μL与25μL用PBS/T稀释的HBsAg（10mg·L-1 ）混匀，加入包被好的ELISA板中，以未加HBsAg的噬菌体（25μL噬菌体和25μL PBS/T）为对照，按说明书的步骤进行操作，在酶联计数仪（490nm）上读取结果并计算抑制率（抑制率（%）=100-（加HBsAg后的A值）/（未加HBsAg的A值）.
    
　　1.6 测序  将重链和轻链分别用SpeI和XhoI，SacI和XbaI切下来，将轻链片段克隆入pUC19测序载体中，将重链片段克隆入pBluscript测序载体中.按美国铂金-埃尔默公司710型测序仪说明书所述步骤进行操作.
    
　　2 结果
   
　　2.1 噬菌体抗体库的筛选  以固相化的人源性HB-sAg作为抗原对噬菌体抗体库进行了3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，尽管从第1轮到第3轮的洗涤次数由1次增加到5次又增加到10次，从固相洗脱下来的噬菌体滴度却显示了明显的增加趋势，第3轮比第1轮增加了40倍（Tab1）.
    
　　表1 亲合吸附筛选对特异性抗体的富集效应　略
   
　　2.2 噬菌体抗体的鉴定  从第3轮筛选后得到的细菌菌落中挑取40个克隆制备噬菌体抗体，用ELISA测定其抗原活性，在酶联免疫计数仪上以波长为490nm读取数据.结果32个克隆均呈现阳性反应，其中4个克隆读数见Tab2.
    
　　表2 噬菌体抗体与HBsAg结合反应的ELISA测定　略
        
　　2.3 竞争抑制试验  将上述的阳性克隆用作抑制试验，并检测其与丙型肝炎检测试剂盒（华美生物工程公司出品）中多肽结合情况（Tab3）.结果是所有的克隆均被HBsAg不同程度的抑制，抑制率在80%以上.从而说明所筛选出来的噬菌体抗体均为乙肝表面抗原的特异性抗体.
    
　　表3 噬菌体抗体的竞争抑制实验　略
        
　　2.4 序列分析  取上述4株中的11号克隆进行序列分析.结果显示，11号克隆的重链属于VH I亚群，轻链可变区VL 属于Vκ I亚群.
    
　　3 讨论
    
　　噬菌体抗体库技术是近年来发展起来的一种新的技术.它通过将抗体的Fab段表达在噬菌体的表面，使表型（与抗原特异结合）和基因型（含有Fab基因）联系在一起，使识别抗原的能力和进行扩增的能力结合在一起.因此可通过“吸附-洗脱-扩增”筛选特异性抗体，成为高效的筛选体系，使人单抗的制备得到了突破性进展
［5，6］ .
   
　　在本研究中，成功地筛选出了抗HBsAg的人单抗.在3次“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程中使特异性的噬菌体抗体富集了40倍.同时挑选了40个克隆进行特异性检测，用ELISA和竞争抑制性ELISA证明了有32个克隆可与HBsAg特异性结合（数据未发表）.所测的序列与GENE BANK相比较证明是抗-HBsAg的单克隆抗体.
    
　　VH of H11GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG E V Q L L E S G G G V V Q P G R TCC CTG AGA CTC TCC TGT ATA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT S L R L S C I A S G F T F S S Y CCT ATG ACC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG CDR1P M T W V R Q A P G K G L E W V GCA AGT ATA TCA TAT GAC GGA AGT TAT AAA TAT AAG GTA GAC TCC ATG CDR2A S I S Y D G S Y K Y K V D S M AAG GGC CGA CTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT K G R L T I S R D N S K N T L Y TTG GAA ATG AAC AGC CTG ACA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT L E M N S L T A E D T A V Y Y C GCG AGG ACA GCT TTC TTT AAC GCC TAT GAC TTC TGG GGC CAG GGA ACC CDR3A R T A F F N A Y D F W G Q G T CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC L V T V S S A S T K G P S V F P CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC L A P S S K S T S G G T A A L G TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC C L V K D Y F P E P V T V S W N TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG S G A L T S G V H T F P A V L Q TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC S S G L Y S L S S V V T V P S S AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC S L G T Q T Y I C N V N H K P S AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT N T K V D K K V E P K S C D K T CAC ACA H T L κ of L11GGA ATT GTG TTG ACC CAG TCT CCA GGC ACC CTG TCT TTG TCT TCA GGG G I V L T Q S P G T L S L S S G GAA GGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC AAC GGC CDR1E G A T L S C R A S Q S V S N G CAA TTA ACC TGG TAC CAG CAG AAG CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC Q L T W Y Q Q K P G Q A P R L L ATC TAT GGT GCA TCC AGC AGG GCC ACT GGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT CDR2I Y G A S S R A T G I P D R F S GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGA CTG GAG G S G S G T D F T L T I S R L E CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAG TGT CAC CAG TAT GAT GGC TCC CCG CDR3P E D F A V Y Y C H Q Y D G S P GAG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAT CGA ACT GTG E T F G Q G T K V E I N R T VGCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA A A P S V F I F P P S D E Q L K TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA S G T A S V V C L L N N F Y P R GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC E A K V Q W K V D N A L Q S G N TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC S Q E S V T E Q D S K D S T Y S CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA S S T L T L S K A D Y E K H K V GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGA TCG CCC GTC ACA Y A C E V T H Q G L R S P V T K AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG S F N R G E E C
 
　　图2 略
 
　　参考文献:
    
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　　编辑 许福明
 
　　1 第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西西安710033，
    
　　2 空军广州医院全军肝病中心，广东广州510600
 
　　作者简介: 廖琪桦（1972-），女（汉族），广西柳州人.硕士生（导师陈苏民，杨安钢）.Tel.（029）3374517Ext.14（O） Email.qihua-liao@hotmail.com 
（责任编辑：labweb）