建立cDNA文库时cDNA的合成条件

黄宝成　陈志南　黄文晋　姜绍谆
　　关键词: cDNA合成;逆转录酶;温度;时间
 
　　 0 引言
 
　　建立cDNA文库并从中筛选出目的基因是一种十分有效的寻找未知基因的手段.cDNA文库的构建过程可粗分为总RNA的提取，mRNA的纯化，cDNA的合成以及将cDNA克隆入载体等几个主要步骤，其中cDNA的合成是其中最复杂也是文库建立成败的关键步骤.我们在建立肝癌细胞cDNA文库时经历了多次cDNA的合成过程，对其中的某些条件作了比较研究，得到了一些有益的经验.
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 材料  合成cDNA所用mRNA是从肝癌细胞系HHCC提取;禽源反转录酶AMV系Promega公司产品;基因工程反转录酶ExpandTM Reverse Transcriptase系宝灵曼公司产品;［α32 P］-dCTP系北京亚辉生物医学工程公司产品;紫外分光光度计Spectrometer lambda14系Perkin Elmer公司产品;放射性计数仪Radiation Monitor系美国SE公司产品.
    
　　1.2 合成cDNA时反转录酶的选择  mRNA经过紫外分光光度计验证其纯度并准确定量后分成2份，1份以AMV为反转录酶，另1份以ExpandTM Reverse Transcriptase为反转录酶，2份反应均以Oligo（dT）15 为引物，在反应体系中加入［α32 P］-dCTP.反应结束后进行14g·L-1 的碱性琼脂糖凝胶电泳，压上X光片.24h后显影以观察合成效果，具体操作参照文献［1］.相同实验至少重复3次.
    
　　1.3 cDNA合成过程中反应温度和时间的控制  在确定了反转录酶的种类之后，将cDNA合成反应分成2组，进行两种不同温度和时间过程的控制.第1组按传统方法，即以42℃，60min合成cDNA第一链，然后16℃，4h合成cDNA第二链;第2组以42℃，45min然后升温至48℃，15min合成cD-NA第一链，以12℃，60min，22℃，60min合成cDNA第二链，两组同样以［α32 P］-dCTP掺入法验证cDNA合成效果.同位素掺入情况以cDNA电泳后放射性计数仪测得的每分钟计数为准.
    
　　2 结果和讨论
    
　　2.1 构建cDNA文库对反转录酶的质量要求高  经过多次重复实验，证实以AMV为反转录酶合成的cDNA第一链比较正常，片段分布区域较宽，而第二链合成却有比较突出的缺陷，片段分布范围较窄（小于4.0kb），片段集中区分子量偏小（小于1.0kb），有明显的降解现象.这种结果可能与AMV本身含有较强的RNaseH活性及在酶的生产过程中难以避免污染有核酶内切酶有关［2］ .以ExpandTM Reverse Transcrip-tase为反转录酶合成的cDNA两链均正常，特别是cDNA第二链分布较广（从0.3～9.0kb），且片段集中区在2.0kb上下，完全符合哺乳动物细胞mRNA的分布规律.此酶为基因工程产品，它的RNaseH活性已被突变掉，且它的生产过程也可避免外源性污染.构建文库的逆转录反应有它不同于其他逆转录反应（如RT-PCR）的特点:cDNA合成反应进行的时间长，合成的cDNA片段长度不均一且片段大小分布范围广.所以它对反转录酶的要求也较高，我们在构建文库时应充分考虑这一点.
    
　　2.2 cDNA合成反应时间可以缩短  放射性计数值与cD-NA的合成量是呈正相关的，我们对3次实验中2组不同温度、时间控制下合成的cDNA进行了计数.结果组1的3次反应计数值分别为16850，16778和16760r·min-1 （平均值为16796r·min-1 ）.组2的3次反应计数值分别为16876，16802和17118r·min-1 （平均值为16932r·min
-1 ）.2组计数值虽略有差别，但无统计学意义，说明在2组反应条件下cDNA的合成效果相当.第2组反应条件是我们针对酶的特性制定的［3］ ，当反转录酶作用42℃，45min时，大部分mRNA模板会被反转录成cDNA第一链，但可能也有少数二级结构较复杂的mRNA不能被反转录.当我们升温至48℃再反应15min，可以将这部分有复杂二级结构的mRNA反转录成cDNA.cDNA第二链合成时，先在12℃低温反应，以保证RNaseH在低活性状态下即能在mRNA/cDNA杂合链上使mRNA产生缺口，又不至于产生大的缺失，再将反应陡升至22℃以便最大限度地发挥DNA聚合酶活性，快速将mRNA置换成cDNA第二链，这样就大大缩短了反应时间（较传统方法缩短2h），提高了工作效率.
 
　　参考文献:
    
　　［1］萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T（金冬雁，黎孟枫等译）.分子克隆实验指南［M］.第2版.北京:科学出版社，1992:437-441.
 
    ［2］Verma IM.Reverse transcripatase.In:Boyer PD ed.The en-zymes ［M］.3rd ed.New York:Academic Press，1981;14:87-95.
 
    ［3］奥斯伯F，布伦特R，金斯顿RE etal（颜子颖，王海林译）.精编分子生物学实验指南［M］.北京:科学出版社，1998:88-91，103-104.
    
　　编辑 王 睿
 
　　第四军医大学基础部:　1 细胞工程研究中心，
   
　　　　　　　　　　　　 2 全军神经科学研究所，
   
　　　　　　　　　　　　 3 微生物学教研室，陕西西安710033
 
　　基金项目: 国家863课题资助项目（863-102-09-01）
    
　　作者简介: 黄宝成（1968-），男（汉族），江西省清港市人.博士，讲师.Tel.（029）3374547
（责任编辑：labweb）