产品介绍

转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA。转录组测序能够从整体水平研究基因表达量以及基因结构，揭示特定生物学过程中的分子机理；目前已广泛应用于基础研究、临床诊断、药物研发和分子育种等领域。

产品路线

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样本要求

福尔马林固定石蜡包埋。

送样要求：新鲜FFPE组织切片，厚度不超过10um（过厚会导致RNA得率低），每次用量大约8片，表面积不超过250mm2。

常温运输保存。

分析内容

序号 分析项目 类别 分析 备注
1. 原始数据整理、过滤及质量评估 A √
2. 参考基因组注释整理与统计 A √
3. 比对结果质控 A √
4. 基因表达量统计 A √
5. 测序饱和度分析 A √
6. 基因覆盖均一度分析 A √
7. 样品相关性检验 A 内部生物学重复之间
8. 基因表达模式分布 A 样品数 ≥3
9. 基因表达差异分析 A √ 样品数≥2
10. 差异表达双向聚类分析 A 基因或样品≥3
11. PCA分析 A √
12. 表达差异基因GO富集分析 A √
13. 表达差异基因KEGG通路富集分析 A √
14. 表达差异基因聚类分析 A √
15. cSNP分析 A √
16. 可变剪切分析 A √
17.       UTR分析 A √
18.       新转录位点分析 A √
19.       组间共有特有差异基因可视化 B 实验分组≥3
20.       转录组可视化平台搭建 B 提供客户软件及使用方法
21.       转录本表达差异分析 B 需要有生物学重复
22.       外显子表达差异分析 B 需要有生物学重复
23.       蛋白网络互作分析 B √ 客户提供关注蛋白
24.       基因组圈图 B 要求基因组完成图
25.       共表达网络分析 B 样品数≥20

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图1 样品相关性检验

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图2 基因差异表达火山图

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图3 不同组间的差异

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图4 基因有向无环图

为确保Reads有足够高的质量，将下机原始测序数据（raw reads）去掉含有带接头的、低质量的reads，得到clean reads，保证后续分析的准确性。测序因受测序仪本身、测序试剂、样品等因素影响，存在一定的错误率。碱基测序错误率分布图可以反映测序数据的质量。

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参考序列比对

将Clean Reads与参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，定位区域分为Exon（外显子）、Intron（内含子）
和Intergenic（基因间区）。比对到参考基因组上的Reads称为Mapped Reads，Mapped Reads占Clean Reads的百分比，可以评估所选参考基因组组装是否能满足信息分析的需求。

基因表达水平分析

生物学重复的相关性不仅可以检验生物学实验操作的可重复性，还可以评估差异表达基因的可靠性和辅助异常样品的筛查。

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重复相关性评估

生物学重复的相关性不仅可以检验生物学实验操作的可重复性，还可以评估差异表达基因的可靠性和辅助异常样品的筛查。

差异表达基因分析

差异表达基因以火山图、MA图、韦恩图、聚类热图、蛋白互作图等形式呈现，通过火山图（Volcano Plot）可以快速地查看基因在两个（组）样品中表达水平的差异，以及差异的统计学显著性。对于有生物学重复的样本，我们采用DEseq进行样品组间的差异表达分析，获得两个生物学条件之间的差异表达基因集；对于没有生物学重复的样本，使用EBseq进行差异分析。筛选差异基因标准一般为：Fold Change≥2，FDR<0.01。

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差异表达基因聚类分析

聚类分析用于判断差异基因在不同实验条件下的表达模式，可通过将表达模式相同或相近的基因聚集成类，从而识别未知基因的功能或已知基因的未知功能，同类基因可能具有相似的功能或共同参与同一代谢过程。

差异表达基因GO分类

差异表达基因GO注释分类统计图，直观的反映出在生物过程（biological process）、细胞组分（cellular component）
和分子功能（molecular function），所有基因和差异基因注释GO term的个数分布。可深入挖掘差异基因的功能及所在的信号通路，筛选关注差异基因注释情况。

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差异表达基因蛋白互作网络

STRING收录多个物种预测的和实验验证的蛋白质-蛋白质互作的数据库，包括直接的物理互作和间接的功能相关。结合差异表达分析结果和数据库收录的互作关系对，构建差异表达基因互作网络。

 

常见问题

  • 简述真核转录组常规建库流程

    1）通过磁珠和mRNA的polyA结构将mRNA分离出来；

    2）mRNA片段化；

    3）mRNA反转录为双链结构，第二链cDNA合成时，其中的碱基T，被替换成U，从而达到链特异性文库的目的；

    4）5’末端修复、3’末端加A；

    5）加接头；

    6）选择特异长度回收，一般为300bp；

    7）PCR；

    8）上机测序。

  • 如何对得到的数目较多的差异基因进行后期验证？
    首先根据GO或者KEGG富集结果，或者客户关注的基因，选取有代表性的进行qRT-RCR验证。然后根据RPKM值，选择RPKM值差异倍数答，同时p值小的基因进行qRT-RCR验证。