原标题：文献速递 | M2巨噬细胞外泌体通过抑制中性粒细胞NETs从而减轻脓毒症损伤
2023年8月，南京鼓楼医院麻醉科马正良教授、顾小萍教授团队联合上海新华医院麻醉科石学银教授团队于《J Biomed Sci》 (IF=11.0)杂志上发布了文章《Exosomal PGE2 from M2 macrophages inhibits neutrophil recruitment and NET formation through lipid mediator class switching in sepsis》。该研究探究了M2巨噬细胞衍生的外泌体（M2-Exos）是否可以通过调节异常的多形核中性粒细胞（PMN）行为来预防脓毒症相关 ALI 期间潜在的有害炎症效应。结果揭示了M2-Exos抑制PMN迁移和NET的形成、减轻肺损伤以及降低脓毒症死亡率等方面的作用，从而强调了M2-外泌体可能是针对脓毒症患者中PMN介导的组织损伤的一种更好的治疗方法。
背景：过多的多形核中性粒细胞（PMN）募集或过多的中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成可导致脓毒症期间多器官功能障碍的发生。M2巨噬细胞衍生的外泌体（M2-Exos）在一些炎症性疾病中表现出抗炎活性，可介导器官功能保护，但其在治疗脓毒症相关急性肺损伤（ALI）中的作用仍不清楚。在这项研究中，我们试图研究 M2-Exos 是否可以通过调节异常的 PMN 行为来预防脓毒症相关 ALI 期间潜在的有害炎症效应。
方法：对 C57BL/6 野生型小鼠进行盲肠结扎穿刺 (CLP) 小鼠模型以模拟体内脓毒症，并在 CLP 后 1 小时腹膜内施用 M2-Exos。通过H&E染色、免疫荧光和免疫组织化学研究肺组织损伤、PMN浸润和肺内NET形成。我们进一步证明了 M2-Exos 对 PMN 功能的作用，并通过使用从健康志愿者和脓毒症患者中分离的 PMN 进行体外共培养实验探索了潜在机制。
结果：在此，我们报告 M2-Exos 抑制脓毒症小鼠模型中 PMN 迁移和 NET 形成，减轻肺损伤并降低死亡率。在体外，M2-Exos 显著降低 PMN 迁移和 NET 形成能力，通过上调 PMN 中 15-脂氧合酶 (15-LO) 的表达，导致脂质介质类别从促炎白三烯 B4 (LTB4) 转变为抗炎脂氧素 A4 (LXA4) 。LXA4 受体拮抗剂治疗减弱了 M2-Exos 对 PMN 和肺损伤的影响。从机制上讲，富含 M2-Exos 的前列腺素 E2 (PGE2) 是通过作用于 EP4 受体来增加 PMN 中 15-LO 表达、上调 LXA4 产生以下调趋化因子（C-X-C 基序）受体 2 (CXCR2) 和活性氧 (ROS) 所必需的，最终抑制PMN功能。
结论：我们的研究结果揭示了 M2-Exos 在通过脂质介质类别转换调节 PMN 迁移和 NET 形成中以前未知的作用，从而强调了 M2-Exos 在控制脓毒症患者中 PMN 介导的组织损伤方面的潜在应用。
来自 M2巨噬细胞的外泌PGE2可通过EP4受体增加 PMN 中15-LO 的表达，上调 LXA4 的产生，从而下调 PMN CXCR2 和 ROS 的表达，抑制 PMN 的迁移能力和 NET 的形成，减轻肺损伤并降低脓毒症的死亡率。
1、M2-Exos 减少肺损伤并提高脓毒症小鼠的存活率
首先，从培养至 M0 表型 (M0-Exos) 或 M2 表型 (M2-Exos) 的小鼠 Raw264.7 巨噬细胞的上清液中分离和纯化外泌体，并使用透射电子显微镜进行形态学表征。如图1a所示，分离的微泡呈圆形、杯状形态，直径约为100 nm。此外，NanoSight分析确定纯化的外泌体的粒径分布约为100 nm（图1b），蛋白质印迹显示M0-Exos和M2-Exos中外泌体特异性标记物CD63、CD9和TSG101高表达（ 图1c）。
为了研究 M2-Exos 在脓毒症相关 ALI/ARDS 生物学中的功能，作者建立了盲肠结扎穿刺 (CLP) 诱导的脓毒症模型，该模型在临床上与人类脓毒症腹膜炎一致，并且 M0-Exos 或 M2- 手术后 1 小时腹膜内 (i.p.) 施用 Exos（图 1d）。离体荧光成像显示，腹腔注射后24小时，Dil标记的外泌体在肺组织中积累，并与Ly6G（中性粒细胞特异性标记物）共定位（图1e，f）。肺组织的组织病理学表现显示，CLP手术后中性粒细胞明显积聚，肺泡间隔增厚，M2-Exo治疗后肺损伤减轻（图1g）。与组织学评估一致，腹腔注射 M2-Exos 显著抑制 CLP 后肺组织中促炎介质（IL-6、IL-1β 和 TNF-α）的表达（图1h）。此外，与 M0-Exo 治疗组相比，M2-Exo（150 或 300 µg/小鼠）治疗显著增加了动物的存活率（图1i），而两组之间的肺部没有显著差异（图1j）。为了确定M2-Exos是否影响CLP诱导的组织损伤和不同阶段的小鼠致死率，在CLP后1天给予M0/M2-Exos（300 µg/小鼠），M2-Exos仍然表现出对肺损伤的显著保护作用 并提高了脓毒症小鼠的存活率。所有这些数据表明M2-Exos可以减轻肺损伤并提高脓毒症小鼠的存活率。
图 1 M2-外泌体可减轻肺损伤并提高脓毒症小鼠的存活率。
2 M2-Exos 在体内脓毒症期间抑制 PMN 募集和 NET 形成
脓毒症的高致死率与宿主炎症反应失调有关，包括 PMN 异常激活的有害影响。因此，作者决定测试 M2-Exos 是否可以抑制脓毒症中 PMN 的过度激活。腹腔注射 M2-Exos 显著减少了 CLP 后外周血（图 2a，b）和肺组织（图 2c，d）中 PMN 的数量，表明 PMN 从骨髓到循环的募集受损，最终到器官。
此外，之前的一项研究表明，NETs主要在肺部观察到，NETs促进细菌清除，但也可以直接诱导对组织的细胞毒性作用，进而在脓毒症期间传播炎症并导致器官损伤。在该的研究中，抗瓜氨酸组蛋白 H3 (CitH3) 和抗 MPO 的免疫荧光染色表明，M2-Exo 治疗减少了 CLP 小鼠肺组织中 NET 的形成（图 2e）。M2-Exo 处理的小鼠血浆 dsDNA 和可溶性 NET 成分（MPO-DNA 复合物）的含量显著低于 M0-Exo 处理的对照组（图 2f，g）。
图 2 M2-Exos 可抑制体内脓毒症期间 PMN 的招募和 NET 的形成。
3 M2-Exos 在体外抑制脓毒症期间 PMN 募集和 NET 形成
为了进一步确定M2-Exos是否可以限制PMN的趋化性和NET形成能力，作者建立了体外共培养系统。如图3a所示，来自健康志愿者的PMN首先被脓毒症血浆激活，然后与源自人PBMC分化的巨噬细胞的50-150 µg/mL M0/M2-Exos共培养。外泌体的表征以及 PMN 对 Dil 标记的外泌体的吞噬作用。与M0-Exo处理组相比，M2-Exo处理后PMN向IL-8的迁移显著减少（图3b）。此外，从脓毒症患者中分离出的 PMN 向 IL-8 的募集也受到 M2-Exos 的抑制（图 3c、d）。
随后，作者在健康志愿者和脓毒症患者中分离出的 PMN 中观察到典型的 NET 结构形成，这些 PMN 与脓毒症患者 (SP) 的血浆一起孵育，但与健康对照 (HP) 的血浆没有形成。在用M2-Exo培养PMN时，作者发现与M0-Exo组相比，脓毒症血浆诱导的NET形成显著减少（图3e-h）。此外，脓毒症血浆可以抑制PMN凋亡，而脓毒症血浆后用M2-Exos处理对PMNs的凋亡率没有影响。所有这些数据表明，M2-Exos 具有抑制脓毒症期间 PMN 趋化性和 NET 产生的能力。
图 3 M2-Exos 可抑制体外脓毒症过程中 PMN 的招募和 NET 的形成。
4 M2-Exos 导致脓毒症期间 PMN 的脂质介质类别转换
接下来，作者研究了 M2-Exos 如何抑制 PMN 的迁移和 NET 形成能力。对于中性粒细胞，先前的研究表明，在急性渗出物形成过程中，类二十烷酸生物合成从主要促炎脂质介质 LTB4 转换为抗炎脂质 LXA4 可以“重新编程”渗出中性粒细胞以促进消退，这一过程称为“脂质介质类别转换”。然而，这一过程是否也在脓毒症炎症消退中发挥作用仍不清楚。使用液相色谱高分辨质谱对 M0/M2-Exo 处理的 PMN 中花生四烯酸 (AA) 衍生的类二十烷酸进行靶向代谢分析，结果表明，与 M0-Exo 组相比，LTB4 的浓度显著降低 (P < 0.05) 在从健康志愿者中分离出的经 M2-Exo 处理的 PMN 中，15-羟基二十碳酸酯-四烯酸 15-HETE（LXA4 由 15-HETE 代谢产生）的浓度显著较高（P < 0.05）（图 4a) 和脓毒症患者 (图 4b)。本研究中的进一步ELISA还表明，脓毒症血浆增加了从健康志愿者中分离出的PMN上清液中LTB4的产量（图4d），而M2-Exos显著增加了LXA4浓度（图4c和e）并降低了LTB4浓度 （图 4d 和 f）从健康志愿者和脓毒症患者中分离出的 PMN 上清液中。此外，M0-或M2-Exo携带的LTB4没有发现显著差异（图4g），外泌体中LXA4浓度也没有发现显著差异，低于ELISA试剂盒的检测限。所有这些结果表明，M2-Exos 在脓毒症期间将 PMN 中 LTB4 的产生转变为 LXA4。
图 4 M2-Exos 导致脓毒症期间 PMN 的脂质介质类别转换。
5 M2-Exos 通过 LXA4 上调抑制 PMN 募集和 NET 形成
LXA4 是一种重要的内源性脂质，通过作用于 LXA4 受体/甲酰肽受体 2 (ALX/FPR2) 来介导炎症的消退。为了测试 LXA4 产生上调是否介导 M2-Exos 对 PMN 的抑制功能，作者选择 BOC-2（LXA4 受体拮抗剂）来消除 LXA4 的作用。首先，作者进行了体外共培养实验，发现从健康志愿者和脓毒症患者中分离出的 PMN 的迁移和 NET 形成能力被 M2-Exos 抑制，并被 BOC-2 治疗逆转（图 5a-c）。为了证实 LXA4 在 M2-Exo 诱导的对 PMN 迁移和 NET 形成的抑制作用中的作用，作者还进行了关于 BOC-2 和外源 LXA4 对 M0-Exo 处理的 PMN 的影响的实验。结果显示，BOC-2不影响M0-Exo处理的PMNs的迁移和NET形成能力，而在M0-Exo处理的PMNs中添加外源LXA4则抑制了NET的形成和中性粒细胞的迁移能力。
为了进一步研究M2-Exos在体内的LXA4依赖性作用，作者在CLP模型中通过腹腔注射共同施用M2-Exos和BOC-2，发现BOC-2增加了小鼠血浆中NET成分的浓度（图5d，e）和肺部的 NET 沉积（图 5f）与 M2-Exo 组相比。作者还观察到，与 M2-Exo 相比，用 M2-Exos + BOC-2 治疗脓毒症小鼠时，外周血（图 5g，h）和肺组织（图 5i，j）中 PMN 的募集显著增加。与肺中 PMN 募集和 NET 形成增加一致，M2-Exos 对肺组织形态变化和促炎介质产生的保护作用被 BOC-2 消除（图 5k，l）。此外，与仅使用 M0-Exo 组相比，在 CLP 模型中同时给予 LXA4 和 M0-Exos 减少了 NET 形成和中性粒细胞向循环和肺组织的迁移，并减轻了肺损伤，而 BOC-2 -Exo组治疗与 M0 组没有差异 。这些数据表明，M2-Exo 介导的 CLP 诱导的 PMN 迁移和 NET 形成的减少依赖于 LXA4。然而，目前尚不清楚 LXA4 上调如何改变 PMN 行为。
图 5 M2-Exos 通过上调 LXA4 抑制 PMN 募集和 NET 形成。
6 M2-Exos 增加 LXA4 下调 PMN 中 CXCR2 和 ROS 表达
趋化因子（C-X-C 基序）受体 2 (CXCR2) 是一种关键的趋化因子受体，负责中性粒细胞趋化至感染部位。此外，CXCR2 信号传导诱导的活性氧 (ROS) 依赖性 NET 形成已被证明是脓毒症的治疗靶点。因此，作者推测 M2-Exos 上调 LXA4 可以通过调节 CXCR2 和/或 ROS 表达来抑制 PMN 活性。正如预期的那样，与 M0-Exos 相比，从健康志愿者和脓毒症患者中分离出的 PMN 中的 CXCR2 和 ROS 表达均被 M2-Exos 下调，而 BOC-2 则相反（图 6a-d）。此外，在CLP模型中，BOC-2消除了M2-Exo诱导的外周血中性粒细胞中CXCR2和ROS下调（图6e，f）。外源性添加 LXA4 可降低体外和体内PMN 中 CXCR2 和 ROS 的表达。所有这些数据表明，M2-Exos 上调 LXA4 对 PMN 的影响可能是通过下调 CXCR2 和 ROS 表达来介导的。
图 6 M2-Exos 增加的 LXA4 可下调 PMN 中 CXCR2 和 ROS 的表达。
7 M2-Exos 通过增加 15-LO 表达促进 PMN 中 LXA4 的产生
接下来作者研究了 M2-Exos 如何增加 PMN 中 LXA4 的产量。先前的研究表明，花生四烯酸15-脂氧合酶（15-LO）活性与花生四烯酸5-脂氧合酶（5-LO）结合可以产生脂氧素，而单独的5-LO活性则形成白三烯[27]。如图4a和b所示，M2-Exos增加了PMN中15-LO产物、15-HETE浓度，表明M2-Exo处理后诱导了更高的15-LO活性。此外，作者发现M2-Exos增加了从健康志愿者和脓毒症患者中分离出的PMN中15-LO的表达，而5-LO的表达保持不变（图7a，b）。用PD146176（一种特异性15-LO抑制剂）处理，显著降低了M2-Exo处理的PMN上清液中的LXA4浓度并增加了LTB4浓度（图7c，d）。PD146176还增加了M2-Exo处理的PMN的迁移和NET形成能力，并且在15-LO抑制后添加外源LXA4消除了PD146176的作用（图7e-g）。流式细胞术显示，PD146176处理后，M2-Exo处理的PMN中CXCR2和ROS表达增加，添加LXA4可逆转这种情况（图7h，i）。所有这些结果表明，M2-Exos 通过增加 PMN 中 15-LO 的表达来促进 LXA4 的产生。
图 7 M2-Exos 通过增加 15-LO 的表达促进 PMN 中 LXA4 的产生。
8 来自 M2 巨噬细胞的外泌体 PGE2 对于 15-LO 上调和 PMN 抑制是必需的
最近的一项研究报道，PGE2 可以通过改变脂质介质生物合成和引导中性粒细胞表型改变来促进炎症的消退。正如作者的目标代谢物分析结果所示，M2-Exo 处理的 PMN 中的 PGE2 浓度往往高于 M0-Exo 处理的 PMN 中的浓度（图 4a、b）。因此，作者试图确定 PGE2 是否可以通过 M2-Exos 转移，以及 M2-Exos 中的 PGE2 是否介导其对 PMN 的抑制作用。首先，作者发现M2-Exos中的PGE2水平显著高于M0-Exos中的PGE2水平（图8a）。与健康对照处理的 PMN 组的血浆相比，脓毒症血浆 (SP) 处理略微增加了培养的 PMN 上清液中的 PGE2 水平，而与 M0-Exo 组相比，M2-Exo 处理显著增加了 PGE2 水平。为了删除 M2-Exos 中的 PGE2，作者通过塞来昔布（一种选择性环氧合酶-2 (COX-2) 抑制剂）阻断 PGE2 的产生。塞来昔布处理的M2巨噬细胞（Cel-M2-Exos）的外泌体中的PGE2水平显著低于M2-Exos（图8a）。正如预期的那样，Cel-M2-Exo 处理的 PMN 中的 15-LO 表达低于 M2-Exo 处理的 PMN 中的表达，并且向 Cel-M2-Exos 中添加外源 PGE2 增加了 PMN 中的 15-LO 表达（图 8b），表明 M2-Exo 治疗后 PMN 中 15-LO 的上调依赖于 PGE2。此外，Cel-M2-Exo处理的PMN显示脂质介质类别转换受损，而PGE2的添加模拟了M2-Exos对LXA4和LTB4改变的影响（图8c，d）。
此外，体外共培养实验表明，Cel-M2-Exo组与M2-Exo组相比中PMN的NET形成（图8e，f）、中性粒细胞迁移能力（图8g）、CXCR2（图8h）和ROS表达（图8i）均增加。，而在培养基中补充PGE2逆转了Cel-M2-Exo对PMN的影响。
为了确认体外实验获得的结果，作者腹腔注射 M2-Exos 或 Cel-M2-Exos。CLP后一小时，作者发现NET形成增加（图8j-l），中性粒细胞从骨髓运输到循环系统（图8m，n）和肺组织（图8o，p），并且表达增加 与M2-Exo给药相比，Cel-M2-Exo给药后外周血中性粒细胞中CXCR2（图8q）和ROS（图8r）的变化。此外，Cel-M2-Exo组的肺损伤评分（图8s）、肺组织中促炎介质产生（图8t）和死亡率（图8u）均显著高于M2组 -Exo组。
为了进一步阐明 PGE2 在 M2-Exos 中的保护作用，作者进行了有关 PGE2 对 SP/SP + M0-Exo 处理的 PMN 的直接影响的实验。首先，检查了PMN的活力，结果显示PGE2（100 nM）处理并不影响SP/SP + M0-Exo处理的PMN的凋亡率。PGE2 增加了 SP 和 SP + M0-Exo 处理的 PMN 中 15-LO 的表达。此外，PGE2 显示出将 LTB4 生产转换为 LXA4 生产的能力。NET形成、中性粒细胞迁移能力、CXCR2 和ROS表达 PGE2 治疗后 PMN 均下降。还确定了 PGE2 对 CLP 小鼠脓毒症相关 ALI 的直接影响，结果显示 NET 形成减少，中性粒细胞从骨髓转运至循环系统和肺组织，外周血中性粒细胞中CXCR2和ROS表达降低。此外，M0-Exos + PGE2组的肺损伤评分和肺组织中促炎介质的产生均显著低于M0-Exo单独组。
总的来说，这些数据表明，源自 M2 巨噬细胞的外泌体 PGE2 增加了 PMN 中 15-LO 的表达，从而上调 LXA4 的产生，然后调节中性粒细胞的迁移能力和 NET 形成能力。
图 8 M2 巨噬细胞的外泌 PGE2 是 15-LO 上调和抑制 PMN 的必要条件。
9 来自 M2 巨噬细胞的外泌体 PGE2 对于 15-LO 上调和 PMN 抑制是必需的
PGE2 已被证明可通过 PMN 的 EP4 受体在体内发出信号，然后增加 15-LO 表达。为了进一步测试来自 M2 巨噬细胞的外泌体 PGE2 是否通过作用于 EP4 受体来调节中性粒细胞表型，作者使用特异性拮抗剂 (E7046) 来阻断 PGE2 与其受体 EP4 的结合。M2-Exos + E7046组中的15-LO表达显著低于M2-Exo组。E7046 处理后，M2-Exo 诱导的 LXA4 和 LTB4 改变被阻断。E7046治疗还增加了NET形成、中性粒细胞迁移能力、CXCR2和ROS表达在 PMN 中，而 LXA4 的添加消除了 E7046 对 PMN 的影响。
此外，使用 CLP 模型的体内实验表明，与相比，E7046 增加了肺部 NET 沉积以及小鼠血浆中 NET 成分的浓度仅 M2-Exo 组。作者还观察到外周血和肺组织中 PMN 的募集显著增加，并且 CXCR2 和 ROS 表达增加与仅使用 M2-Exo 的组相比，用 M2-Exos + E7046 处理 CLP 小鼠时，外周血中性粒细胞中的值升高。M2-Exos 对 CLP 小鼠肺组织形态变化和促炎介质产生的保护作用也被 E7046 消除。
这项研究揭示了源自M2巨噬细胞的外泌体PGE2在增加PMN中15-LO的表达、上调LXA4的产生以下调PMN CXCR2和ROS的表达、抑制PMN迁移和NET的形成、减轻肺损伤以及降低脓毒症死亡率等方面的作用，而这些作用迄今尚不为人知。这些发现可能为巨噬细胞外泌体-PMN之间的相互影响增添了新的内容，因此M2-Exos可能是针对PMN介导的脓毒症患者组织损伤的一种更好的治疗方法。
参考文献：
Jiao Y, Zhang T, Liu M, Zhou L, Qi M, Xie X, Shi X, Gu X, Ma Z. Exosomal PGE2 from M2 macrophages inhibits neutrophil recruitment and NET formation through lipid mediator class switching in sepsis. J Biomed Sci. 2023 Aug 2;30(1):62. doi: 10.1186/s12929-023-00957-9. PMID: 37533081; PMCID: PMC10394797.
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