原标题：宇玫博干货外泌体鉴定金标准TEM操作图解
声明:本次操作基于我司最近正在使用的HT7700;
详细图解内容请关注:“宇玫博生物”公众号;
首先,我们看看电镜的原理是啥?
然后,电镜的结构也是比较复杂的!
那么,我们看看样品有哪些要求?
样品要求:
1、能被电子束穿透(薄)
2、耐电子束轰击
3、有磁性的样品不可以放置
4、长纤维样品若需上样需加盖铜网
接下来,我们看看规范化拍摄Umibio是怎么操作的?
1、送样要求:样品尽可能浓,颗粒浓度1.0E+10;
2、拍摄规范:样品以茶托状(有明显凹陷的)球形,椭球形或扁圆形,尺寸在30-150nm,有双层膜结构的颗粒为目标进行拍摄;照片以轮廓清晰,分辨率高,焦距合适(既没有过焦的虚影,也没有欠焦的黑边),背景杂质少,明暗适宜,颗粒居中,整体美观为佳;
默认拍摄100nm一张,200nm三张,500nm一张;
注:铜网中样品焦距无法调清时以调试后的最佳结果拍摄,样品中无特征明显的颗粒或无颗粒时,拍摄500nm的样品颗粒物或制样“地形”三张;
命名:样品名-标尺-张数。
那么问题来了,我们是怎么制样的呢?
1、制样用品:培养皿,滤纸,碳膜铜网,无尘纸;计时器, 镊子,10μL移液枪及枪头等;
2、制样步骤:
1)滤纸铺在培养皿内,用镊子将通网正面朝上小心放置在滤纸上;
2)移液枪取10μL样液滴在铜网上,呈水滴状站立,计时2min,使样本颗粒渗透,2min后用针头将液滴挑开;
3)取10μL染液以同样方式滴在铜网上,染色1.5min,染色结束后用针头将液滴挑开,用无尘纸将多余染液吸掉。
重点来了,电镜的详细操作步骤有哪些?
1、确认所有COL电源的按钮为ON,启动PC;
2、左上角“operation”下,打开“加速电压/灯丝设定”窗口和“CCD相机操作”窗口;
3、点击“HV on”加速电压上升,点击“Filam on”灯丝电压上升;
4、上样前操作-拔出样品杆
1)将样品杆顺进样轨道平行线向外拔,至有阻力拔不动时顺时针右转小角度(约15°),再次向外拔;
2)至有阻力拔不动时逆时针左转(约45°)至样品杆上定位销完全移至定位销孔,样品仓红灯亮起;
3)将样品仓放气按钮向下拨至“Air”一侧,放气后灯灭,向外拔出样品杆。
5、上样中操作;
5.1将样品杆小心放在支架上,塑料把手在左,样品端在右;(样品杆银色不锈钢部分可以手碰,黄铜部分不可以用手触摸)
5.2样品装入样品杆:
(1)用小圆杆抵住样品杆前端小孔,按住往左推拉,另一只手用镊子夹住压片左端小角取出压片;
(2)用镊子夹住样品对准样品杆前端小圆洞放入;
(3)压片凹面朝上,圆洞对准样品杆上圆洞,两角抵住右端凹槽放在样品杆上;
(4)用小圆杆抵住样品杆前端小孔,按住往左推拉,压片自然落下,松手后压片被抵住;
(5)用洗耳球吹走灰尘;
6、上样后操作-插入样品杆。
6.1将样品杆按照定位销与销孔对应的方向插入至有阻力,将样品仓排气按钮向上拨至EVAC一侧,红灯亮;
6.2等抽真空完成后,绿灯亮起,并伴随“滴—”的声音,紧接将样品杆小心顺时针右旋至有阻力时,微微逆时针左旋,再将样品杆完全送进样品仓,上样完成。
7、点击 “Beam on”:待左上角束流加至10μA左右时,可以开始调试参数寻找目标样品;
8、“LENS RESET”——初始化参数;
9、“BRIGHTNESS”键——调节亮度;移动轨迹球——调节视野;“MAGNIFICATION”键——调节放大倍数;
10、调节光圈;
11、调节样品高度;
12、目标样品寻找记录:
12.1通过调节放大倍数,视野亮度和轨迹球找到目标样品并将其移动到视野中央;
12.2调节“BRIGHTNESS”至亮度到-12,点击“RUN”,进入放大模式;
12.3左右旋转“FOCUS”调焦;
12.4设置照片附带信息;
12.5设置照片保存路径;
12.6固定照片并保存;
12.7点击“stop”退出拍照模式;
13、点击“Beam off”,结束拍照;
14、勾选并点击“RESET”,使镜头归位;
15、可以重新更换样品继续拍照,或取出样品结束拍照,结束后样品杆需放回样品仓内;
16、数据上传:在电镜旁边的电脑上按保存位置找到自己拍摄的照片,双击快捷方式打开数据上传客户端,将文件夹拖到页面中,输入自己的账户,等待数据上传结束。
17、关机
17.1依次点击“Filam off”,“HV on”,关掉拍照和电压灯丝窗口;
17.2数据传输电脑关闭后,将COL按钮按到“O”一侧,关闭仪器。
最后,我们看看有哪些常见问题吧!
1、视野飘逸,无法聚焦和固定照片
1)上样没有夹紧铜网;
2)电子束轰击,破坏碳膜;
3)上样/制样过程中铜网正反颠倒;
2、染色过深或过浅:染液:5%磷钨酸溶液,PH中,染色1.5min;
3、照片不够清晰,对比度较弱
1)制样太厚;
2)相机原因;
3)手动调节Gamma可适当增加对比度-耗时;
4、视野中的杂质是什么:大白圆球,大梭形,小黑圆球,不明颗粒。
宇玫博生物专业从事于外泌体产品开发和技术服务的高科技公司。2015年成立于上海张江高科技园区,是国内最早开展外泌体研究、服务及相关试剂开发的专业公司,现已发展为专业化外泌体药物递送和试剂方案的供应商。
公司拥有2000平米GMP标准厂房,高端仪器设施设备,实现生产规范化、规模化,为进入国际市场打下基础。
业务范围包括:新型药物载体的研发、外泌体规模化提纯和生产、外泌体诊断试剂研发、外泌体相关产品的销售等,核心技术解决了外泌体规模化提纯、外泌体药物递送、外泌体标记等技术难点。
目前已经为诺和诺德、和元生物、吉凯基因、津曼特生物、清华大学、北京大学、浙江大学、复旦大学等机构提供过外泌体产品和技术服务。
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