加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）、BioNano Genomics公司和10X Genomics公司的研究人员最近推出了一种新方法，用于人类基因组序列的从头组装（de novo assembly）及定相（phasing），该方法结合了short-read测序、linked-read测序以及基因组作图。相关成果于5月9日发表在《Nature Method》上，是对去年西奈山伊坎医学院Matthew Pendleton等人方法的扩展。
Pendleton等人的方法利用Pacific Biosciences公司的long-read序列，但UCSF领导的研究小组将其换成了10X Genomics公司的linked-read数据。已有研究表明10 X的数据可用于检测人类生殖细胞系和癌症基因组单倍型。
UCSF的Pui-Yan Kwok和他的同事还进行了一项试点研究，利用这种方法对来自HapMap计划的一个基因组进行测序和组装，发现他们的方法与其他方法相比效果相当，甚至更好。
新方法的具体思路
研究人员在文章中指出，阻碍人类基因组组装质量提高的原因包括，人类基因组的重复性、与其他真核生物基因组的相似性、二倍体特性以及缺乏能产生精准long reads而且成本低的DNA测序平台。
Kwok和他的同事写道，“通过这项原理验证研究，我们发现可以结合三组互补的图谱/测序数据来克服这些问题，这些数据可以在一般的实验室中短时间内同时生成，并且成本合理。”
Kwok和他的同事描述的新方法主要依赖于两种平行过程。首先用SOAPdenovo短寡核苷酸分析软件将Illumina测序reads组装。为了将得到的scaffolds组装成更长的片段，研究人员将10X GemCode平台产生的序列数据结合到组装中，利用fragScaff程序生成新的scaffold。同时，他们还利用BioNanoGenomics公司的Irys系统生成了一个序列基序的物理图谱，将这个物理图谱与10X数据生成的scaffold结合，最终生成一个混合组装的基因组图谱。进一步利用10X公司的Long Ranger软件对混合组装得到的scaffolds进行phasing，用BioNano Genomics的物理图谱帮助解决一些重复区域的问题。
对HapMap样本NA12878的试点研究
作为一项试点研究，研究人员用这个方法对HapMap样本NA12878进行组装和phasing。
最初利用Illumina组装的NA12878基因组产生了超过1.4万个scaffolds，scaffold N50为0.59Mb，而利用10X和BioNano Genomics图谱相结合的方法组装产生了更少的scaffolds和更高的scaffold N50值。混合组装的方法产生了170个scaffolds，scaffold N50大小为33.5Mb，这个组装结果相比于最初的Illumina组装结果提升了57倍。另外，研究人员表示，phasing的平均片段大小为4.7Mb，phasing出约280万个SNV，占总比例97.2%。
与参考基因组相比，研究人员发现他们的组装结果比2011年发表的利用ALL-PATHS组装得到的基因组更加精准，与Pendleton等人发表的结果有95.2%相似。他们表示新的组装结果中展示了95.7%的外显子。
新方法的局限性
但是Kwok和他的同事表示，虽然这种方法能够对基因组组装起到提升作用，但是也存在一些局限性。
例如，他们提到10X测序需要制备高分子量的DNA，所以存档样品可能不能使用。除此之外，linked reads是由50kb~100kb的随机k-mer扩增产生的，但这些分子并不一定总是会扩增。因此，需要构建更多不同大小的测序文库减少这些N-base gaps，这样就增加了工作量。
他们还指出了一些可以改善的方面。他们认为通过构建更大的插入片段，10X测序数据可以用于延伸contig或者填补相邻contig间的gap。
相关文献：A hybrid approach for denovo human genome sequence assembly and phasing. Nature Methods (2016)doi:10.1038/nmeth.3865.
Assembly and diploidarchitecture of an individual human genome via single-molecule technologies. NatureMethods 12, 780–786 (2015) doi:10.1038/nmeth.3454.
（责任编辑：sgx）
