纽约大学Langone医学中心的一项新技术能够读取DNA的碱基序列，以足够的精确度揭示细菌是如何进行高速进化抵抗抗生素的。这项技术称作“最大深度测序”（Maximum Depth Sequencing，MDS），消除了现有的高通量DNA测序仪核心技术引发的错误，并可捕获那些早期测序方法无法从机器错误中区分出的罕见遗传变异。这项结果于6月22日发表在《Nature》杂志上。
文章通讯作者、纽约大学Langone医学中心生物化学和分子药理学系教授、霍华德休斯医学研究所研究员Evgeny Nudler博士说，“我们第一次能够直接检测到细菌遗传密码中DNA序列的标准变化率，以及变异速度比平均速度快数倍，以致使抗生素失效的‘热点位点’”。
Nudler还说，“除了抗生素耐药性，该技术可能很快就能帮助我们检测到任一细胞群中极度罕见的遗传变异，包括血液中即将发生癌变的细胞和癌变前的细胞。”
“最大深度测序”方法的原理
先进的高通量测序仪可以在约10小时内确定一个人基因组的30亿个碱基的顺序，小型的细菌基因组所需的时间则更少。借助于这个能力，研究人员对碱基的随机改变与疾病的关联有了新的认识。
为了确定DNA样本中的碱基顺序，该技术会将DNA链打断成片段，利用DNA聚合酶复制每个片段序列并引入barcode标记，每个标记都能唯一识别初始DNA片段。测序仪进一步生成每个拷贝的大量副本，数量达到足以利用发光探针技术捕获并按顺序鉴定出序列中的每个碱基。
Nudler说，标准方法的问题在于，最初聚合酶复制阶段产生的错误会呈现在所有的序列拷贝中。这使研究人员无法将这些错误与在DNA序列中自然发生且与疾病相关的罕见突变区分开。
这项研究的一个创新点就是利用聚合酶在初始DNA片段末端添加barcode，而不是生成该片段容易出错的拷贝进行测序，进而将这些错误放大。该方法会进一步生成大量独立的带有barcode标记的初始DNA片段。通过这种方式，任何由于聚合酶引入的错误，或者某个测序仪测序过程中产生的错误，都只会出现在一部分序列中，因此使我们能够排除这些错误。
不同于对整个基因组进行测序，新方法专注于从更短的DNA区域开始。专注于感兴趣的DNA区域，研究人员能够在一次运行中对每一个初始DNA片段进行多次测序。
揭示细菌耐药性机制
研究人员观察了环境对DNA链不断的破坏和DNA快速修复机制间的速度关系。专家预测细菌细胞内每小时DNA的损伤达到数千次，但是修复机制意味着它们的DNA密码随时间推移而缓慢的改变。
使用新的技术，研究者们能够第一次以足够的统计学严谨性，准确计算大肠杆菌中标准的持续的突变率。与基础突变率比较，研究人员发现，当大肠杆菌暴露于抗生素时，大肠杆菌基因组中某些区域突变发生的频率比平均突变率高10倍。
具体来说，研究小组发现，采用不足以全部杀死细菌的氨苄青霉素和诺氟沙星的剂量，会引起细菌细胞内的氧化应激和DNA损坏，关闭错配DNA的修复。压力上升使得细菌更加快速的改变它们的DNA密码，根据抗生素治疗情况进行进化。
Nudler说，“我们永远都看不见这些过程，但是现在有希望解决细菌的耐药性问题。”
MDS除了能够发现细菌DNA中的罕见突变，还有望用于检测人类细胞群中的罕见变异。Nudler说，利用血液检测可以在肿瘤形成很早以前就识别出细胞中罕见的“癌前”遗传突变。
（责任编辑：sgx）
