ChIP-Seq测序与分析

染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA 相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP 与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq 技术，能够高效地检测全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。

ChIP-Seq 的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA 区段信息。

推荐平台

Ilumina HiSeq2000、 Ion Proton

生物信息分析

1. 原始数据整理、过滤及质量评估
2. ChIP-Seq序列与参考基因组序列的比对
3. Peak Calling（统计每个样品的Peak片段信息）
4. Peak Annotation（根据已有的基因组数据库注释信息获得所有Peak位点信息）
5. Motif预测、基因集分析
6. 全基因组范围的峰值分布
7. 样品间差异Peak分析
8. 基因组水平和感兴趣区域的数据可视化

优势

1.根据实际需求可个性化定制测序及分析方案。

2.严谨的实验流程和可靠的检测结果，保证数据分析结果准确可信。

3.分析结果的图表参考国际顶级期刊设计，可直接用于文章写作。

4.与转录组等数据进行联合分析，深度挖掘生物信息资源。

技术路线

样本要求

接收ChIP后DNA样本，只需进行建库，要求：DNA总量20ng，浓度0.5ng/ul以上。

分析内容及结果

Peak Calling

Peak 的长度与蛋白质结合区域大小紧密相关，是非常重要的信息。Peak 在外显子、内含子、5’ UTR、3’ UTR、基因间区等区域上的分布情况如下：

Peak在功能元件上的分布

Peak相关基因GO注释

将 GO 注释结果对应到 GOTerm 上，并统计第二级分类上注释到目标基因的数目

GO注释图

差异Peak相关基因KEGG富集分析

统计各个KEGG Pathway 不同层级上包含的差异表达基因数目，进而确定差异表达基因主要参与的代谢途径和信号通路。

KEGG富集分析

Motif分析

Motif是一些有特征的短序列，在基因组上常常反复出现，经常是一些具有序列特异性的蛋白的结合位点（如转录因子），或者是涉及到一些重要的生物过程（如转录起始，转录终止， RNA 剪切等等）。

motif示意图

常见问题

• Input是什么，有什么作用

  input是指样本经过超声，但是没有进行ChIP，包含样本超声后总DNA，可以进行电泳，检测超声效果，同时，可以与最后ChIP样本进行比较，看ChIP的效率（如果用同一引物进行PCR，ChIP组和input组亮度差不多，说明ChIP效率高，基本上，样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了，反之，说明效率低，实验条件有待改进）

• ChIP-seq测序需要多少数据量？

  推荐20M reads /样本的数据量。

• ChIP-Seq是所有物种都能做吗

  不是，研究对象应该是有参考基因组的动物，注释完整。

• 文库制备过程是否需要PCR 扩增？PCR 扩增后是否会影响最后的结果？

  基于第二代测序平台的ChIP-Seq在文库制备过程中需要进行PCR，主要是为了获得足够上机反应的DNA量，如果提供的DNA样品足量，可减少PCR循环数。因此由PCR引起的偏向性非常小。

• DNA 片段范围的跨度会对后续测序有影响吗？

  有影响，定量准确性、测序质量与数据产量都可能受到影响，而且跨度越大，影响越大。通常我们要求打断后DNA电泳主带在100-500 bp 范围内，主峰介于200-300 bp。目前在建库过程中允许的最长跨度为200 bp。

• ChIP-Seq是否需要做阴性对照测序？

  通常可以选择Input作为对照进行测序，也可根据经费情况灵活安排。

• 哪些因素会影响ChIP-Seq的结果？

  抗体的质量与特异性、实验设计、ChIP的实验操作、DNA片段长度范围、测序深度、测序质量等都会影响ChIP-Seq的结果。