简化基因组测序2b-RAD

2b-RAD技术（Wang et al, Nat. Methods, 2012）是指基于IIB型限制性核酸内切酶的简化基因组测序技术。通过对IIB型内切酶酶切基因组产生的等长tag进行高通量测序，可以大幅降低基因组的复杂度，同时不受有无参考基因组的限制，快速进行全基因组范围内大规模SNP标记的开发与分型。与传统的简化基因组技术RAD-Seq相比，2b-RAD技术获得的标记数目更多、分型准确率更高，可用于高密度遗传图谱构建、QTL定位、全基因组关联分析、群体进化研究、辅助基因组的组装、全基因组选择育种等。

技术特色
不经过片段大小选择，技术重复度好
具有极强的灵活性，标签数目多少可控
标签长度一致，PCR时具有一致的扩增效率
根据每个客户的研究目标和内容灵活定制研究方案
共显性标记之外还可以开发显性标记
基于混合泊松分布模型的de novo SNP分型算法iML，有效去除重复序列对分型的干扰

简化基因组测序利用限制性内切酶获取基因组上与酶切位点关联的序列片段，进行高通量测序，获得海量标签序列来代表研究物种的全基因组信息。常见的简化基因组技术主要有RAD（Restriction site Associated DNA）、GBS（Genotyping By Sequencing）等。主要目的是开发分子标记，进而进行种质资源鉴定、群体进化、GWAS、图谱构建、BSA定位等，为功能基因的挖掘及标记辅助育种提供理论基础。

应用领域：

遗传图谱构建及QTL定位

群体遗传学分析

局部组装及新分子标记开发

产品优势：

相对于全基因组重测序，成本相对低，研究所需数据量低，极大简化了基因组

对于大量样本、基因组比较大、高杂合或研究相对落后的物种具有极高的性价比

检测范围广，可适用于各类育种群体，有无参考基因组均可进行研究

无参考基因组：不受已知基因组序列的限制，可大规模筛查SNP位点，降低基因组的复杂度，测序成本降低，适合在群体水平进行研究

有参考基因组：数据分析简便，且能够有效开发新的SNP位点

技术路线：

推荐测序模式
● Hiseq X-Ten, PE150 ● 4 M reads/1 G基因组大小

案例展示
案例一白灵菇遗传图谱的构建和基因组组装

研究背景

白灵菇是一种可商业栽培的蘑菇品种，越来越受到中国和其他亚洲国家的欢迎。但是由于其产量低、栽培时间长和对病害敏感等问题，导致白灵菇的商业利润非常低。因此，提高白灵菇的重要农艺性状是当前育种工作所需要的。分子标记辅助育种尚未应用到白灵菇，遗传图谱和物理图谱的构建，是遗传育种和分子标记技术的基础，能够大大加速育种工作进程。

研究内容

采用2b-RAD技术对来源于白灵菇杂交菌株（H6PA X H6PB）的115个单核菌株进行遗传图谱的构建；然后对1株单核菌株进行de novo测序，将基因组scaffolds和遗传图谱相结合，辅助基因组scaffolds的拼接。最后，本研究对交配型位点A和B进行了鉴定。

研究结果
1.平均每个样本获得1.1M高质量reads，平均测序深度49X，共获得1770个SNP标记，其中1711个SNP标记用于构建遗传图谱。遗传图谱共包括12个连锁群，1182个标记，图谱总长度为1073 cM，标记平均间隔1.0 cM。
2.白灵菇单核菌株489P1进行de novo测序（Hiseq2500, PE125），共获得500个scaffolds（≥500bp），组装基因组大小为40.83Mb，GC含量50.22%，与杏鲍菇基因组共线性高。
3.遗传图谱上的1151个SNP标记（97.4%）可以定位到78个scaffolds，覆盖整个白灵菇基因组的83.1%（33.9Mb），绝大多数SNP与物理图谱的共线性良好。
4.交配型位点A和B分别位于不同的连锁群，并在白灵菇基因组上被鉴定到。交配型B位点的5个可能的信息素受体和2个可能的信息素前体也被检测到。
5.这是白灵菇第一个遗传图谱与基因组de novo测序整合的研究，为白灵菇的分子育种工作提供了基础。
参考文献
Gao W, Qu J, Zhang J, et al. A genetic linkage map of Pleurotus tuoliensis integrated with physical mapping of the de novo sequenced genome and the mating type loci. BMC Genomics 2018; 19(1): 18-31. (IF: 3.729)